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選擇AAV血清型應根據目標細胞類型和組織來決定。例如,AAV2常用于肝臟、AAV8適用于肌肉、AAV9適用于心臟和中樞神經系統。通過參考文獻或初步實驗,確定最適合的血清型。
AAV滴度可以通過多種方法測定,如實時PCR、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、病毒斑形成單位(PFU)測定等。選擇合適的方法應根據具體實驗需求和實驗室設備條件。
可能原因:
1. 蛋白翻譯后修飾復雜,細胞未能正確處理而導致蛋白被降解
2. 蛋白質含有特殊序列(如高度重復序列),導致蛋白表達低或不正常
3. 表達系統不合適
哺乳動物細胞蛋白表達體系可表達的蛋白大小范圍通常在10 kDa到150 kDa之間。
桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統能夠表達具有完整生物學功能的蛋白質,適合容納和表達較大的外源片段,是表達大片段DNA的理想選擇。
雖然桿狀病毒-昆蟲細胞系統不具備哺乳動物細胞的所有翻譯后修飾能力,但它能夠進行一些基本的翻譯后修飾,如糖基化和磷酸化,適合大多數功能研究和生產應用。
酵母表達系統兼具原核和高等真核系統的優點,具有培養條件普通、生長速度快、成本低、可進行蛋白翻譯后加工、易獲得可溶性活性重組蛋白等特點。
巴斯德畢赤酵母因其快速生長、商業化表達載體豐富和高效分泌表達的優點,成為酵母表達重組蛋白的優先選擇。
原核蛋白表達系統(如大腸桿菌)具有快速、高產量、經濟實惠等優勢,適用于大規模蛋白生產。
可以采用密碼子優化、改變表達宿主菌株、調整表達條件(如溫度、培養基組分等)等方法來提高可溶性蛋白的表達水平。
在大腸桿菌表達系統中,部分外源蛋白可能會由于錯誤折疊而形成包涵體,主要原因包括外源蛋白的復雜結構或毒性。
1. 提高蛋白表達量:密碼子優化可以顯著提高外源基因在宿主細胞中的表達量,為后續的分離純化等步驟提供便利。
2. 提高翻譯效率:通過減少稀有密碼子的使用,可以避免翻譯過程中的瓶頸,提高整體的翻譯效率。
3. 改善mRNA穩定性:優化后的mRNA二級結構更加穩定,有利于核糖體的結合和翻譯過程的順利進行。